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描述：pUC57 Simple 通用克隆載體采用了 TOPO 酶連接技術，載體預先偶聯(lián)上 TOPO 酶，當加入 PCR 擴增產物后，5 min 就可以完成連接反應，連接陽性率高。pUC57 Simple 通用克隆載體消除了大部分的常用酶切位點，便于后續(xù)亞克隆。該產 品適用于 Taq 酶擴增的含“A"尾巴和高保真酶擴增的 PCR 產物的連接，載體含有氨芐青霉抗性篩選標記。 

注意：RTS DH5α 凍干感受態(tài)在未溶解狀態(tài)下，可于-20℃長期保存（>2 年），已經溶解后，請-60℃以下保存（3 個月）。
主要特征
（1）快速連接，最快僅需 5min；（2）操作簡單，僅需加入載體和片段即可；（3）無需藍白斑篩選，陽性率高；（4）不包含
任何酶切位點，便于后續(xù)亞克?。?）平末端和 A 尾產物通用。
注意：引物不能磷酸化。
測序引物
正向測序引物：M13F(-47): 5’- CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’；
反向測序引物：M13R(-48): 5’- AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’；
操作步驟
1. PCR 產物的純化
1.1 PCR 擴增完畢后，電泳檢測產物，如無非特異性擴增、無引物二聚體、條帶單一明亮，則可采用 PCR 產物純化試劑
盒純化后用于連接。產物不經純化也可以進行連接，但效果稍差一些。
1.2 PCR 擴增完畢后，電泳檢測產物，如有非特異性擴增條帶或引物二聚體，則必須采用膠回收后用于連接。
1.3 PCR 擴增模板來源于 Amp 抗性質粒，則必須采用膠回收后用于連接。
2. PCR 用量和連接時間
PCR 產物大小 PCR 產物用量 載體用量 摩爾比 連接時間 陽性率
0.1~1kb 2～10ng 1 μl 1: 5~10 5～10min >95%
1~3kb 10～20ng 1 μl 1: 5~10 15～20min >90%
>3kb 5ng/kb 1 μl 1: 5~10 30min >85%
3. 連接反應
向 0.2 ml EP 管中依次加入如下試劑
成 分 用 量
PCR 產物 0.5~4 μl （用量參考上表）
pUC57 Simple Vector 1 μl
加無菌水至總體積為 5 μl
輕輕吹打混合均勻后，室溫（25°C）孵育 5～30min，通常放置 10min。
關于 PCR 產物的用量說明：在 PCR 產物回收后（在無法進行 NanoDrop 測定濃度的情況下），按照一般的經驗可估算產物
的用量，原則為：3 μl 回收產物在瓊脂糖凝膠電泳后，可清晰判斷的情況下，使用 0.5~1 μl 回收產物（約 5~15 ng）進行連
接即可?；厥债a物難以觀察的情況下使用 4 μl 回收產物（約 5~10 ng）進行連接。使用過高量的 PCR 產物將會導致連接效
率低下，長斑數(shù)量和陽性率急劇下降。

PCR 反應需要使用哪些試劑和設備？

試劑:
模板DNA：PCR反應需要模板DNA，如從細胞、組織、血液中提取DNA等；引物：PCR反應的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；dNTPs：PCR反應中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細胞分裂、DNA合成等生物學過程，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增；Taq DNA聚合酶：PCR反應需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴增DNA鏈；PCR buffer溶液：對PCR反應具有緩沖作用，調節(jié)反應pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛，可增強PCR反應特異性，從而提高反應效率；酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組、構建和測序等等實驗步驟，常常需要進行酶切操作。MARK:一種分子量標準，用來判別DNA片段大小的工具。DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應產物；
設備：
PCR儀：用于控制反應溫度，保證PCR反應時不同溫度環(huán)節(jié)的嚴格控制；電泳槽：用于分離PCR擴增產物；核酸提取儀：從組織樣本中全自動提取核酸。  這些試劑和設備在PCR分子生物學技術中均是，只有在有序齊全的基礎上，才能進行PCR反應并得出準確結果。

PCR相關基礎實驗：

PCR反應基本步驟一般的聚合酶鏈式反應由20到35個循環(huán)組成，每個循環(huán)包括以下3個步驟：

一、變性：

利用高溫（93-98℃）使雙鏈DNA分離。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷。在第一個循環(huán)之前，通常加熱長一些時間以確保模板和引物分離，僅以單鏈形式存在。該步驟時間1-2分鐘，接下來PCR儀就控制溫度進入循環(huán)階段。

二、退火或稱接合,復性：

在DNA雙鏈分離后，降低溫度使得引物可以結合于單鏈DNA上。此階段的溫度通常低于引物熔點5℃。錯誤的退火溫度可能導致引物不與模板結合或者錯誤地結合。該步驟時間1-2分鐘。

三、延伸：

DNA聚合酶由降溫時結合上的引物開始沿著DNA鏈合成互補鏈。此階段的溫度依賴于DNA聚合酶。該步驟時間依賴于聚合酶以及需要合成的DNA片段長度。傳統(tǒng)的Taq估計合成1000bp/min、較新的Tbr（來自于嗜熱菌Thermus brockianus）約40秒、商業(yè)公司生產的融合型聚合酶僅需約10-15秒。

PCR反應條件優(yōu)化：

1、變性溫度和時間：

保證模板DNA解鏈是保證整個PCR擴增成功的關鍵。加熱90~95°C, 30~60s，再復雜的DNA 分子也可變性為單鏈。溫度過高或高溫持續(xù)時間過長，可對Taq酶活性和dNTP分子造成損害。

2、復性溫度和時間:

PCR擴增特異性取決于復性過程中引物與模板的結合。復性溫度越高，產物特異性越高。復性溫度越低，產物特異性越低。需根據(jù)引物的Tm值具體設定。

3、延伸溫度和時間:

一般位于Taq酶最適作用溫度70~75°C之間。引物小于16個核苷酸時，過高的延伸溫度不利于引物與模板的結合，可以緩慢升溫到70~75°C。延伸反應時間，可根據(jù)待擴增片段的長度而定，小于1kb, 1min足夠；大于1kb需加長延伸時間。Taq酶可根據(jù)1kb/min增加時間。這里需要注意，延伸時間過長可能出現(xiàn)非特異擴增。因此需要設置恰到好處的延伸時間。

4、循環(huán)數(shù):

其他參數(shù)選定后，PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。理論上說20?25次循環(huán)后，PCR產物的積累即可達到最大值，實際操作中由于每步反應的產率不可能達到100%，因此不管模板濃度是多少，20~30次是比較合理的循環(huán)次數(shù)。循環(huán)次數(shù)越多，非特異擴增增加。

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