商品屬性：

該制品為雙組分的試劑，Basic Buffer Mix 包含了反應(yīng)緩沖液、Mg2+、dU/A/C/GTP(不含 dTTP)、凍干賦形劑，酶 Mix 包含 Bst 4.0 DNA/RNA 聚合酶、熱敏 UDG。得益于 Bst 4.0 識(shí)別 dUTP 底物，反應(yīng)底物中不包含dTTP，因此擴(kuò)增產(chǎn)物均為 dUTP 產(chǎn)物，在配合熱敏 UDG的情況下，實(shí)現(xiàn)防污染性能。在實(shí)際測(cè)試中，含有 10e5Copies 的污染物的條件下，抑制污染擴(kuò)增。本制品尤其適用于開蓋的 LAMP 反應(yīng)（如試紙條檢測(cè)）、密封腔體（污染風(fēng)險(xiǎn)較高）的檢測(cè)試驗(yàn)（如定量 PCR腔體）。
試劑使用特點(diǎn)：
（1）Basic Buffer Mix 中不含染料，可自行添加 SYBR Green、Eva Green 等染料進(jìn)行熒光檢測(cè)。
（2）本試劑適用于開蓋檢測(cè)如核酸試紙條檢測(cè)。
（3）試劑中含有凍干賦形劑，試劑可直接凍干，無需再優(yōu)化凍干配方。

儲(chǔ)存：-20℃保存 1 年；-80℃保存 2 年；短期使用放置于2-8℃，保存 1 個(gè)月。反復(fù)凍融 10 次，不影響使用。如有白色沉淀，于 37℃水浴放置 10min 后溶解沉淀，不影響使用。
使用方法：
1. 配制 LAMP 反應(yīng)體系
2.5xBst4.0 Basic BufferMix 10 μl
25xBst4.0/UDG Enzyme 1 μl
10xLAMP Primer Mix 2.5 μl
模板 DNA/RNA X μl
ddH2O 到總體積 25 μl
10xLAMP Primer Mix 濃度：FIP/BIP 分別為 16 μM、LoopF/B 分別為 4~8 μM、F3/B3 分別為 2 μM。
注意：如何應(yīng)用核酸試紙條進(jìn)行特異性檢測(cè)，可來信咨詢。
2. 反應(yīng)體系配好后，室溫（25-37°C）放置 2min，以消化去除潛在的核酸污染，隨后置于 65°C 進(jìn)行反應(yīng)15~30min。
試劑凍干策略（有凍干經(jīng)驗(yàn)人員操作）：
1. 配制 LAMP 凍干體系
2.5xBst4.0 Basic BufferMix 10 μl
25xBst4.0/UDG Enzyme 1 μl
10xLAMP Primer Mix 2.5 μl
ddH2O 到體積 1.5 μl
凍干總體積 15 μl
2. 體系配制完畢后，加入 0.2 ml EP 管進(jìn)行上機(jī)凍干。該試劑的凍干體積為 15 μl， 檢測(cè)反應(yīng)體積為 25 μl。

特別說明：
（1）本試劑防污染原理為：熱敏 UDG 消化去除含有 dUTP的擴(kuò)增產(chǎn)物，熱敏 UDG 在隨后 50℃以上迅速失活，并不影響后續(xù) LAMP 擴(kuò)增。因此，本試劑無法去除采用 dTTP擴(kuò)增的污染物，也不能消化天然的核酸底物（DNA/RNA）。為避免擴(kuò)增氣溶膠污染，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)長(zhǎng)期使用本試劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，一旦使用 dTTP 試劑擴(kuò)增后，造成實(shí)驗(yàn)室污染，采用本試劑不會(huì)消除假陽(yáng)性擴(kuò)增。
（2）本試劑適用基于 OG 染料變色法、SYBR Green 法、基于 Biotin/FAM 探針的核酸膠體金法（ 具有膠體金法特異性使用策略，如需技術(shù)支持，請(qǐng)來信咨詢）。本試劑不支持 HNB、pH 顯色法。其它使用策略自行優(yōu)化調(diào)整。
（3）基于本試劑， 提供凍干制備服務(wù)。八聯(lián)管起訂量 480T，凍干球起訂量 2000T。

PCR基本步驟及注意事項(xiàng)？

一、實(shí)驗(yàn)原理

PCR是體外人工選擇性擴(kuò)增DNA的一種方法，它類似于生物體內(nèi)DNA的復(fù)制。在生物體內(nèi)DNA復(fù)制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs；而體外PCR反應(yīng)同樣需要類似的成分，有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設(shè)計(jì)的特定序列，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定位置的擴(kuò)增；PCR Buffer提供一個(gè)反應(yīng)的緩沖環(huán)境；反應(yīng)過程同生物體內(nèi)一樣，DNA雙鏈打開，引物結(jié)合模板，延伸形成新鏈。而這些過程在生物體內(nèi)靠DNA解旋酶解鏈，而在體外在通過控制反應(yīng)溫度實(shí)現(xiàn)的。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈，在退火溫度處引物結(jié)合到模板上，最后在72℃完成延伸，并反復(fù)重復(fù)此過程即可實(shí)現(xiàn)對(duì)特定片段DNA的大量擴(kuò)增。到第三循環(huán)開始才產(chǎn)生出和靶DNA區(qū)段相同的DNA分子，進(jìn)一步循環(huán)地產(chǎn)生出靶DNA區(qū)段的指數(shù)加倍。

在擴(kuò)增后期,由于產(chǎn)物積累,使原來呈指數(shù)擴(kuò)增的反應(yīng)變成平坦的曲線,產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱為平臺(tái)效應(yīng)。平臺(tái)期(Plateau)會(huì)使原先由于錯(cuò)配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴(kuò)增，達(dá)到較高水平。因此，應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù)，在平臺(tái)期前結(jié)束反應(yīng)， 減少非特異性產(chǎn)物。到達(dá)平臺(tái)期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。

二、主要的成分

1.模板可以是多種形式，主要包括基因組DNA、質(zhì)粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產(chǎn)物，cDNA等，但不能為RNA。對(duì)于不同類型的模板，其主要不同在于預(yù)變性的時(shí)間以及模板的量。一般對(duì)于大的基因組DNA預(yù)變性時(shí)間10min足夠，質(zhì)粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預(yù)變性2min、PCR產(chǎn)物預(yù)變性2min即可。

注意cDNA為單鏈DNA，但仍可做PCR的模板，只不過在第一輪循環(huán)時(shí)只有一個(gè)引物結(jié)合，合成另一條鏈。從第二輪開始，兩個(gè)引物均與特異位點(diǎn)結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)了與常規(guī)PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進(jìn)行PCR擴(kuò)增，原因就在于實(shí)現(xiàn)PCR反應(yīng)的是DNA聚合酶，只能特意識(shí)別DNA鏈。

2.對(duì)于模版的量來說，一般25ul體系DNA的質(zhì)量為50—100ng。對(duì)于基因組DNA由于其結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，提取的濃度也往往比較大，為防止?jié)舛冗^大對(duì)PCR造成影響，故需對(duì)提取的DNA進(jìn)行梯度稀釋。否則濃度過高則可能會(huì)引起非特異性擴(kuò)增。對(duì)于質(zhì)粒及PCR產(chǎn)物由于其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，且提取濃度一般較低，則無需稀釋。

PCR實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該注意的問題有哪些?

沒有ct值

檢測(cè)結(jié)果遇到?jīng)]有Ct值情況,排查是否有以下問題:

1、循環(huán)數(shù)不夠(一般不超過45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準(zhǔn));

2、PCR程序設(shè)置錯(cuò)誤,檢測(cè)熒光信號(hào)的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時(shí)采集,TaqMan法則一般在退火結(jié)束時(shí)或延伸時(shí)采集信號(hào),另外熒光采集是否選中;

3、引物或探針降解?？赏ㄟ^PAGE電泳檢測(cè)引物和探針是否降解;

4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據(jù)試劑盒說明書即可), 對(duì)未知濃度的樣本應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應(yīng)考慮樣本準(zhǔn)備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲(chǔ)備,避免反復(fù)凍融;

5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內(nèi)含子,以確保擴(kuò)增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會(huì)影響擴(kuò)增)。

ct值過晚

在相對(duì)定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對(duì)定量中, 對(duì)低拷貝數(shù)的樣品,Ct值會(huì)增大, 但是一般不宜超過40循環(huán), 否則定量不準(zhǔn)確。

因此,判斷Ct值出現(xiàn)過晚是否屬于非正常情況, 需要根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和目的進(jìn)行。

1、擴(kuò)增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進(jìn)行優(yōu)化;引物或探針設(shè)計(jì)不合理, 需要重新設(shè)計(jì);

2、PCR程序不合適, 改用三步法進(jìn)行反應(yīng), 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當(dāng)降低退火溫度; 退火/延伸時(shí)間短(可以在推薦的時(shí)間條件下延長(zhǎng)10s);

3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足;

4、PCR產(chǎn)物太長(zhǎng)。PCR產(chǎn)物設(shè)計(jì)超過500bp;

5、模板中存在抑制物。用高純度模板進(jìn)行PCR檢測(cè)或?qū)⒛０暹M(jìn)行稀釋。

公司正在出售的產(chǎn)品：